淺談丹參酮ⅡA對心肌細(xì)胞損傷的修復(fù)作用的分析論文
1 材料
1.1 動物出生1～3 d雄性Wistar大鼠，SPF級，購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證號SCXK粵-20060015。
1.2 藥品與試劑
胎牛血清購自杭州四季青生物工程研究所；胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基購于Gibico公司；丹參酮ⅡA購于中國藥品生物制品檢定所（批號110766-200417）；乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。
2 方法
2.1 分組原代乳鼠心肌細(xì)胞經(jīng)分離、純化后進行實驗分組，分為以下幾組：①正常組：培養(yǎng)的正常心肌細(xì)胞培養(yǎng)；②模型組：心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中添加200 μmol/L H2O2作用2 h；③丹參酮ⅡA高劑量組：心肌細(xì)胞用丹參酮ⅡA 1×10-4mol/L培養(yǎng)24h后添加200 μmol/L H2O2繼續(xù)作用2 h。④丹參酮ⅡA中劑量組：心肌細(xì)胞用丹參酮ⅡA 5×10-5mol/L培養(yǎng)24 h后添加200 μmol/L H2O2繼續(xù)作用2 h。⑤丹參酮ⅡA低劑量組：心肌細(xì)胞用丹參酮ⅡA 1×10-5mol/L培養(yǎng)24 h后添加200 μmol/L H2O2繼續(xù)作用2 h。
2.2 新生大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)參照Goldenberg等［4］方法略加改進。取出生1～3 d SD乳鼠，在75％酒精中浸泡8s后取出，固定四肢。用無菌眼科剪剪開胸部，無菌眼科彎鑷取出心臟。迅速將心臟放入裝有冷D-Hanks液的培養(yǎng)皿中，去除心房及心外膜的結(jié)締組織，將心室剪開，洗凈殘血，反復(fù)洗3次。將心室肌在無菌培養(yǎng)皿側(cè)壁剪碎成1～2 mm3的小組織塊。將小組織塊移入50 ml塑料離心管中，加入0.1％胰蛋白酶5ml，37℃消化6 min。自然沉淀后去除第1次上清，再加入5 ml胰蛋白酶于37℃消化6 min后，輕輕吹打，自然沉淀后，取上清移入15 ml離心管中，加含血清培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心10 min，洗兩次。剩余沉淀繼續(xù)加胰蛋白酶消化，如此反復(fù)消化7～10次直至組織塊完全消化。將離心所得沉淀用含15％胎牛血清的培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，在CO2培養(yǎng)箱中差速貼壁1 h，去除非心肌細(xì)胞（主要是成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞）。1 h后輕輕吸出細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，將心肌細(xì)胞懸液均勻接種于6孔板內(nèi)，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。前48 h加入終濃度為0.1 mmol/L的5-溴脫氧尿苷，每24 h換液1次。
2.3 心肌細(xì)胞活力檢測 采用MTT比色法測定心肌細(xì)胞活力。心肌細(xì)胞懸液以1.5×104/ml接種于96孔板。分組處理后，每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml），在培養(yǎng)箱中37℃孵育4 h。吸去上清，每孔加入DMSO 150 μl。微孔振蕩器上振蕩10 min。酶標(biāo)儀檢測570 nm波長的吸光度值。每孔OD值減去空白孔OD值為測試孔OD值�；罴�(xì)胞數(shù)與OD值成正比。每組每個時間點設(shè)6個復(fù)孔，取其平均值。
2.4 心肌細(xì)胞凋亡吸出培養(yǎng)液，D-Hanks洗細(xì)胞3次，5 min/次。向培養(yǎng)瓶中加入2～3 ml 0.125％胰蛋白酶（使用前應(yīng)預(yù)熱至37℃左右），鏡下觀察細(xì)胞，待其變圓，細(xì)胞間分離但尚未脫落時倒去胰酶，加入原培養(yǎng)液終止消化，吹打瓶壁，使細(xì)胞脫落。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，1 000 r/min 離心5 min，加PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，取0.5 ml上述細(xì)胞懸液，1 000 r/min 4 min離心，棄上清，加0.5 ml Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入1μl熒光標(biāo)記的Aannexin V試劑，混勻后避光室溫下孵育20 min。加入5μl PI混勻后避光4℃下孵育5 min，孵育后加入500 μl Binding Buffer，立即上流式細(xì)胞儀分析，激發(fā)波長Ex=488 nm; 發(fā)射波長Em=530 nm。
2.5 總抗氧化能力及氧化平衡體系酶測定
采用比色法測定總抗氧化能力（T-AOC），采用2,4-二硝基苯肼顯色法檢測LDH活性，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力，二硫代二硝基苯甲酸法測定GSH-Px含量，鉬酸銨法測定CAT活力。具體操作步驟參照試劑盒說明書。
2.6 統(tǒng)計分析
計量數(shù)據(jù)以均±s表示，采用 SPSS13. 0統(tǒng)計軟件進行分析。多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析 （One Way ANOVA）處理，組間兩兩比較采用LSD法。檢驗顯著性水準(zhǔn)α＝0.05。
3 結(jié)果
3.1 丹參酮ⅡA對過氧化氫所致心肌細(xì)胞損傷的細(xì)胞活力與細(xì)胞凋亡的影響與正常組比較，模型組心肌細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞凋亡率則顯著增加；在改善細(xì)胞活力方面，丹參酮ⅡA高劑量組細(xì)胞活力較模型組顯著增高，而丹參酮ⅡA中劑量、低劑量 與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。在改善細(xì)胞凋亡率方面，丹參酮ⅡA各劑量組細(xì)胞凋亡率均顯著低于模型組，中劑量與低劑量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。丹參酮ⅡA對過氧化氫所致心肌細(xì)胞損傷抗氧化能力的影響與正常對照組比較，模型組心肌細(xì)胞總抗氧化能力、SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性顯著降低，而LDH活性、MDA含量則顯著增加；丹參酮ⅡA可呈劑量依賴性增加總抗氧化能力、SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性，降低LDH活性、MDA含量。
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