中職檢驗專業(yè)白細(xì)胞計數(shù)實驗教學(xué)論文
摘要在運用顯微鏡計數(shù)法進(jìn)行白細(xì)胞計數(shù)的實驗教學(xué)中，容易出現(xiàn)一些問題，如技術(shù)誤差、固有誤差、儀器誤差等。經(jīng)過多年的教學(xué)總結(jié)和仔細(xì)分析，得出一些相應(yīng)的解決方法，以期共同探討。
關(guān)鍵詞中職檢驗專業(yè)；白細(xì)胞計數(shù)實驗；誤差
1引言
中職學(xué)校檢驗專業(yè)學(xué)生在進(jìn)行白細(xì)胞計數(shù)實驗中，容易出現(xiàn)實驗器材使用不當(dāng)、實驗操作不規(guī)范或?qū)嶒灷碚撝R不理解而導(dǎo)致實驗結(jié)果偏差甚至實驗過程受阻等；另外，即使一位技術(shù)熟練者，使用同一儀器在對同一標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)多次操作，檢測結(jié)果也常有一定差異。本文提出白細(xì)胞計數(shù)實驗中容易出現(xiàn)的一些問題即技術(shù)誤差、固有誤差以及儀器誤差等進(jìn)行分析探討且給出相應(yīng)的解決方法，以盡力避免學(xué)生在實驗過程中出現(xiàn)的錯誤操作或無效操作，提高學(xué)生操作效率及能力，達(dá)到更好的教學(xué)效果。
2技術(shù)誤差
由于操作不正確或儀器不精確造成的誤差為技術(shù)誤差。這類誤差通過主觀努力可以避免或降到最低程度[1]。采血部位不同結(jié)果產(chǎn)生偏差世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦采血部位以左手無名指或中指指尖的內(nèi)側(cè)為宜。在我國有些地方仍采用耳垂取血，耳垂部位痛感較輕且不易感染，但其血循環(huán)較差，受溫度變化影響較大，所以一般情況下采用手指部位取血。在學(xué)生實驗操作時，筆者將30名學(xué)生同時采指血和耳垂血，分別進(jìn)行采血取樣進(jìn)行對照。計數(shù)結(jié)果是耳垂血白細(xì)胞數(shù)高于手指血白細(xì)胞數(shù)的為28例，約占93.3%，平均數(shù)值增高1.9×109/L。白細(xì)胞數(shù)目的多少可能與所在采血部位的血管深淺、粗細(xì)、血流速度、血液粘滯度等多種因素有關(guān)。耳垂白細(xì)胞計數(shù)偏高的主要原因可能是耳垂體積小散熱快，所處環(huán)境溫度低，血流慢，血液粘滯度大，白細(xì)胞易于沉積。手指則不然，手指活動量大、體積大，溫度相對高，血流快，血液粘滯度小，白細(xì)胞不易沉積，所以這些可能是手指血白細(xì)胞計數(shù)偏低的主要原因[2]。計數(shù)板不清潔干燥1）計數(shù)板的清潔方法。血細(xì)胞計數(shù)板使用后，取下蓋玻片，用自來水沖洗，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，也可用95%的乙醇、無水乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑脫水使其干燥。另外，計數(shù)板沖洗后,還要通過鏡檢觀察每小格內(nèi)是否殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈,則必須重復(fù)清洗直到干凈為止，干燥后方可放入盒內(nèi)保存或使用。2）計數(shù)板上殘存水滴，會使充液不均，還會造成混合液濃度降低[3]。
解決方法：將計數(shù)板置于清潔環(huán)境，自然干燥或在空氣中快速揮動，如急用也可輕輕甩掉計數(shù)板上水滴后再用濾紙片將殘存水分吸干。3）計數(shù)板上殘留纖維等雜質(zhì)影響鏡下觀察清晰度。解決方法：用流動的清水洗凈計數(shù)板后再進(jìn)行上述具體操作。微量吸管使用不當(dāng)本實驗采用一種改進(jìn)的`微量吸管，屬于醫(yī)療器械技術(shù)領(lǐng)域。它由氣囊和與之管通的吸管一體構(gòu)成，氣囊與吸管管通一端的底部具有孔，吸管上標(biāo)有刻度，故可在采取樣液時利用指壓啟閉其孔實現(xiàn)準(zhǔn)確性，該吸管具有造價低、精確度高、操作簡便靈活的特點，又具有可作為一次性產(chǎn)品使用，能夠避免交叉感染等的優(yōu)點。1）微量吸管折斷。解決方法：微量吸管細(xì)長易斷，在將其插入橡膠頭內(nèi)時，應(yīng)左手持橡膠頭（注意氣囊孔的控制），右手必須持住靠近微量吸管上端的部分輕輕操作，才能有效防止其折斷。2）微量吸管取樣混有氣泡。解決方法：取樣時，需將微量吸管末端完全浸入血樣末端，輕輕抽吸，才不會混入空氣。3）血樣進(jìn)入橡膠頭。解決方法：取樣前應(yīng)先捏緊橡膠頭，封閉氣孔，取樣時將橡膠頭慢慢地、一點一點地松開，如果松開速度過快或力度過大，就會發(fā)生上述現(xiàn)象[4]。取樣操作不規(guī)范以用一次性定量（20μl）微量吸管取末梢血為例，
正確操作是：輕輕吸取末梢血到微量吸管第二個刻度線后再多取一點兒，此時右手捏穩(wěn)橡膠頭不動，左手持干棉球置于微量吸管管尖部位，右手輕捏橡膠頭擠出管內(nèi)多余血樣至剛好到吸管第二個刻度線為止，此時再用左手的棉球?qū)⒐芗馔舛嘤嘌翰恋�。上述每一步驟缺一不可。充液不當(dāng)1）充液量過少造成充液缺損，過多則造成蓋玻片懸浮，細(xì)胞飄忽不定。2）充液時玻棒位置不正確，造成充液缺損或有氣泡。正確操作是：用玻棒蘸取適量混懸液后應(yīng)輕輕接觸蓋玻片一角，讓液體自動進(jìn)入計數(shù)池并剛好充滿后立即移走玻棒。3）充液時間延遲�；鞈乙和瓿珊髴�(yīng)立即充液觀察計數(shù)，有實驗證明如果混懸液放置超過1.5分鐘以上在進(jìn)行充液計數(shù)操作，會使計數(shù)結(jié)果偏低[5]。白細(xì)胞在剛剛混勻的液體中均勻分布，而靜置超過1.5分鐘后白細(xì)胞會逐漸下沉，造成混懸液密度不均，在吸取上層液體充液進(jìn)行計數(shù)時會產(chǎn)生偏差[5]。低倍鏡下看不到計數(shù)池1）了解計數(shù)板的構(gòu)造。血球計數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4個槽構(gòu)成3個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩個計數(shù)區(qū)，每個計數(shù)區(qū)上面各刻有一方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分9個大方格，4個角的大方格作為白細(xì)胞計數(shù)用，每個大方格被單線劃分成16個中方格；最中央大方格被雙線劃分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格，供計數(shù)密度較大的紅細(xì)胞計數(shù)時使用。每個計數(shù)區(qū)由400個小方格組成，計數(shù)區(qū)邊長為1mm，則計數(shù)區(qū)的面積為lmm2，每個小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋玻片后，計數(shù)區(qū)的高度為0.1mm，所以每個計數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3，每個小方格的體積為1/4000mm3。2）計數(shù)板放置位置不正確。
計數(shù)板有上下兩個相同的計數(shù)池，應(yīng)將要觀察的、充好液的一側(cè)置于視野中央。3）光線過強(qiáng)。計數(shù)板放置好后，調(diào)整好焦距，如仍看不到計數(shù)池上的畫線，可能是光線過強(qiáng)的緣故，調(diào)整顯微鏡光圈或遮光鏡至視野較暗，再調(diào)整細(xì)準(zhǔn)焦螺旋至視野清晰即可看到計數(shù)池上的畫線[6]。辨別不出計數(shù)池4個角大方格的位置，解決方法如下。1）先找到計數(shù)池內(nèi)最中央的大方格，特點是橫線與豎線均為雙線劃分的含有25個中方格的大方格，也是線條最密集的大方格就是計數(shù)池內(nèi)最中央的大方格。2）以最中央大方格為標(biāo)的，分別沿上、下、左、右方向移動計數(shù)板，找到外側(cè)兩邊為單線、內(nèi)側(cè)兩邊為雙線的含16個中方格的大方格即分別為四個角上的大方格。顯微鏡下將雜質(zhì)誤認(rèn)為白細(xì)胞1）粉塵顆粒。粉塵顆粒不具備細(xì)胞的基本形態(tài)，低倍鏡下白細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞內(nèi)有深色的核，上下微調(diào)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋白細(xì)胞具有折光性。2）氣泡。氣泡亦不具備細(xì)胞的基本形態(tài)，微調(diào)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋時鏡下顯現(xiàn)為無細(xì)胞結(jié)構(gòu)的空圈。漏數(shù)或重復(fù)計數(shù)1）每一個角上的大方格都被劃分為16個中方格，計數(shù)時應(yīng)以中方格為依據(jù)，按一定方向和順序計數(shù)，如從上到下、從左到右的順序。2）對壓線的白細(xì)胞應(yīng)采取數(shù)上不數(shù)下、數(shù)左不數(shù)右的原則。
3固有誤差
由于因每次白細(xì)胞分布不可能完全相同而造成的偏差叫固有誤差[1]。計數(shù)池內(nèi)細(xì)胞分布不均白細(xì)胞總數(shù)在正常參考范圍內(nèi)時，若每個大方格的白細(xì)胞數(shù)值相差8個以上視為細(xì)胞分布嚴(yán)重不均，可能是混合液密度不均或充液不當(dāng)，需輕輕搖勻混合液重新充液計數(shù)。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)研究白細(xì)胞在技術(shù)池內(nèi)的分布符合Poison分布。其變異系數(shù)CV=1/m，m代表計數(shù)池重復(fù)計數(shù)的白細(xì)胞均數(shù)。通過上式可以得出m越大，CV越小，所以計數(shù)范圍越大，計數(shù)細(xì)胞越多，計數(shù)域誤差越小。常規(guī)考核標(biāo)準(zhǔn)學(xué)生計數(shù)完畢后，通常要用常規(guī)計算標(biāo)準(zhǔn)公式來評判實驗結(jié)果是否達(dá)標(biāo)，否則要重新采血充液計數(shù)。即：RCS=（4個大方格所數(shù)白細(xì)胞數(shù)最大值-最小值）／4個大方格所數(shù)白細(xì)胞平均數(shù)評價標(biāo)準(zhǔn)：白細(xì)胞≤4×109/L時，RCS＜0.3白細(xì)胞=（4.1～14.9）×109/L時，RCS＜0.2白細(xì)胞≥15×109/L時，RCS＜0.15超過上述標(biāo)準(zhǔn)為不合格。
4儀器誤差
計數(shù)板的鑒定要求計數(shù)板的臺面光滑、透明，畫線清晰，計數(shù)池畫線面積準(zhǔn)確，必要時采用嚴(yán)格校正的目鏡測微計測量計數(shù)池的邊長與底面積，用微米千分尺測量計數(shù)池的深度。美國國家標(biāo)準(zhǔn)局（NBS）規(guī)定每個大方格邊長的誤差應(yīng)小于1%，即1±0.01mm，深度誤差應(yīng)小于2%，即0.1±0.002mm。若超過上述標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)棄之不用。蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)蓋玻片應(yīng)平整、光滑、無裂痕，厚薄均勻一致，可使用卡尺多點測量（至少在9個點），不均勻度在0.002mm之內(nèi)，必要時采用平面平行儀進(jìn)行測量與評價，要求呈現(xiàn)密集平行的直線干涉條紋。最簡單的評價方法是將潔凈的蓋片緊貼于干燥的平面玻璃上，若能吸附一定的時間不脫落，落下時呈弧線形旋轉(zhuǎn)，表示蓋片平整、厚薄均勻。同時，合格的蓋片放置在計數(shù)池表面后，與支持柱緊密接觸的部位可見到彩虹。精選出的蓋片與其他蓋片緊密重合后，在掠射光線下觀察，如見到完整平行的彩虹條紋表示另一枚蓋片質(zhì)量也達(dá)標(biāo)。如果蓋玻片不達(dá)標(biāo)勢必會影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。
5其他情況
白細(xì)胞總數(shù)過低計數(shù)完成后，白細(xì)胞總數(shù)過低者（＜3×109/L），可擴(kuò)大計數(shù)區(qū)域或重新加倍取血計數(shù)。白細(xì)胞總數(shù)過高對于白細(xì)胞總數(shù)過高者（＞15×109/L），可增加稀釋倍數(shù)重新計數(shù)，如若是外周血中有核紅細(xì)胞過多，必須再進(jìn)行白細(xì)胞分類計數(shù)，然后用校正公式予以校正除去。校正公式[1]：白細(xì)胞總數(shù)=校正前白細(xì)胞數(shù)×［100/（100+100個白細(xì)胞中的有核紅細(xì)胞數(shù)）］
以上所述大致涵蓋了學(xué)生在白細(xì)胞計數(shù)實驗中容易出現(xiàn)的問題，若能有效克服,必定會大大增強(qiáng)實驗結(jié)果的可靠性。另外，熟能生巧，該項實驗初次完成后，建議再利用一些課時進(jìn)行白細(xì)胞計數(shù)實驗的技能考試，強(qiáng)化規(guī)范操作，為日后進(jìn)行紅細(xì)胞計數(shù)及血小板計數(shù)等實驗打下良好基礎(chǔ)。
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