深究DP2干預(yù)對大鼠海馬神經(jīng)元的作用論文
鋁為地殼中含量最豐富的金屬元素，人類日常生活中應(yīng)用廣泛，主要通過食物、化妝品及建筑材料等途徑攝入。經(jīng)證實(shí)，長期攝入大劑量鋁會產(chǎn)生嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性，表現(xiàn)為行為和認(rèn)知功能障礙、神經(jīng)元損傷，甚至神經(jīng)退行性變，但其具體機(jī)制尚不完全清楚。前列腺素(PGs)是一類多不飽和脂肪酸衍生物，由環(huán)氧化酶(COX)催化花生四烯酸(AA)代謝產(chǎn)生，介導(dǎo)一系列生理病理過程。前列腺素D2(PGD2)是大腦中最豐富的PGs，其合酶(PGDS)有腦型PGDS(L睵GDS)和生血型PGDS(H睵GDS)兩種亞型。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，除少突膠質(zhì)細(xì)胞外，L睵GDS高表達(dá)于神經(jīng)元。PGD2與特異性受體DP1和DP2結(jié)合后，通過受體介導(dǎo)的信號傳遞機(jī)制而發(fā)揮廣泛作用。DP1和DP2都是G蛋白偶聯(lián)受體，分別偶聯(lián)Gs和Gi蛋白，影響環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平而發(fā)揮不同作用。有研究報道，在PGD2 致原代大鼠皮層神經(jīng)元損傷模型中，DP2 拮抗劑BAY瞮3405未發(fā)揮保護(hù)作用，推測DP2 可能不介導(dǎo)PGD2 的神經(jīng)毒性。另也有研究報道，在谷氨酸致原代大鼠海馬腦片損傷模型中，DP2激動劑DK睵GD2明顯升高神經(jīng)元的LDH漏出率及細(xì)胞死亡率，提示DP2介導(dǎo)PGD2的神經(jīng)毒性。出現(xiàn)此矛盾結(jié)果，可能與研究模型不同有關(guān)。DP2作為DP受體中的一員，在鋁鹽致原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元損傷過程中具體是如何變化的，尚未見報道。目前廣泛研究的DP2選擇性激動劑主要有DK睵GD2、15d睵GD2、15d睵GJ2，DP2 選擇性拮抗劑主要有CAY10471、AM461、AZD1981。參考Yue等的報道，我們選擇DK睵GD2、CAY10471作為干預(yù)藥物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元損傷模型中，L睵GDS表達(dá)明顯上調(diào)，DP2表達(dá)明顯下調(diào)，PGD2 含量明顯升高，初步提示L睵GDS睵GD2睤P2信號通路可能參與了神經(jīng)元損傷過程。在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用DP2選擇性激動劑和拮抗劑分別干預(yù)鋁負(fù)荷神經(jīng)元，進(jìn)一步觀察DP2在原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元中的作用。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取孕期18d左右的SD大鼠，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證書號：SCXK(渝)2012-0002。
1.1.2 主要試劑與儀器 麥芽酚(阿拉丁，上海)，DMEM/F12、D睭ank′s(Hyclone，美國)，B27、Neuro瞓asal培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco，美國)，左旋多聚賴氨酸、MTT試劑盒(Sigma，美國)，青霉素-鏈霉素溶液、LDH試劑盒、Fluo3AM(碧云天，上海)，山羊抗兔特異性烯醇化酶(NSE)多克隆抗體(博士德，武漢)，SP試劑盒、DAB顯色劑(中杉金橋，北京)，蘇木精染液、伊紅染液(南京建成，南京)，DK睵GD2、CAY10471(Cayman，美國)，超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(ThermoSci瞖ntific，美國)，超純水系統(tǒng)(Millipore，美國)，低溫冷凍離心機(jī)(ThermoScientific，美國)，激光掃描共聚焦顯微鏡(Bio睷ad，美國)，全自動酶標(biāo)儀(BioTek，美國)。
1.2 方法
1.2.1 大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng) 取孕期18d左右的SD大鼠，斷頸后迅速剪開腹部皮膚和腹膜，將子宮完全暴露后剪斷肌層和臍帶，取出胎鼠并立即浸泡于裝有75%乙醇的燒杯中。約30s后，將消毒好的.胎鼠移入事先準(zhǔn)備的D睭anks液中，斷頭取腦，迅速分離出兩側(cè)完整海馬，放入冰浴的D睭anks液中，用眼科剪將海馬組織剪碎。加入組織體積5倍左右的0125%胰酶，混勻，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化，10min時拿出輕輕吹打數(shù)次。20min后，加入同體積的含10%胎牛血清培養(yǎng)液終止消化。200目細(xì)胞網(wǎng)篩過濾，收集細(xì)胞懸液，800r·min-1離心10min。棄去上清，加入一定量的含10%胎牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，制成細(xì)胞密度為1×106·L-1的細(xì)胞懸液。吸取不同體積細(xì)胞懸液分別接種于左旋多聚賴氨酸包被好的培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4h后，待神經(jīng)元貼壁，換含2% B27的Neurobasal培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，以后每隔3d半量換液1次。海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至d7時長到較好狀態(tài)，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.2.2 原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的免疫化學(xué)鑒定 取6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)至d7的海馬神經(jīng)元爬片(10mm×10mm)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液用PBS漂洗3次;4%多聚甲醛固定30min，PBS漂洗3次，每次2min;3% H2O2 孵育15min，PBS漂洗3次，每次2min;10%山羊血清封閉，37℃孵育20min，吸干血清，不漂洗;NSE多克隆抗體∶抗體稀釋液(1∶50)，以PBS代替一抗設(shè)空白對照，4℃孵育過夜，PBS漂洗3次，每次5min;生物素標(biāo)記山羊抗兔二抗，37℃孵育30min，PBS漂洗3次，每次5min;辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵蛋白素工作液，37℃ 孵育30min，PBS漂洗3次，每次5min;避光條件下，DAB顯色10min，自來水終止反應(yīng);蘇木精染液復(fù)染細(xì)胞核，3min后自來水返藍(lán);95%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片;晾干，鏡下觀察。
1.2.3 MTT測定 將96孔培養(yǎng)板中大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至d7進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，即空白對照組(300μmol·L-1maltol)、鋁負(fù)荷模型組[100μmol·L-1Al(malt)3]、干預(yù)組(Al3+ +10-5、3×10-6、10-6mol·L-1 DK睵GD2、CAY10471)。在加入處理因素后繼續(xù)培養(yǎng)24h，每孔加入20μL的MTT溶液(5g·L-1)，37℃培養(yǎng)箱中孵育4h。棄去孔內(nèi)上清液，加入150μLDMSO，搖床上避光震蕩，以充分溶解結(jié)晶物，于570nm波長處測定吸光度值(OD值)。
1.2.4 乳酸脫氫酶(LDH)漏出率測定 將24孔培養(yǎng)板中大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至d7進(jìn)行實(shí)驗(yàn)藥物處理(分組同“1.2.3”)，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，根據(jù)LDH測定試劑盒說明書具體步驟操作，于490nm波長處測定OD值。計(jì)算公式：細(xì)胞毒性或LDH漏出率/% =(處理樣品OD值-樣品對照孔OD值)/(細(xì)胞最大酶活性的OD值-樣品對照孔OD值)×100。
1.2.5 海馬神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)觀察 將24孔培養(yǎng)板中大鼠海馬神經(jīng)元爬片(10mm×10mm)培養(yǎng)至d7進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，即空白對照組(300μmol·L-1mal瞭ol)、鋁負(fù)荷模型組[100μmol·L-1Al(malt)3]、干預(yù)組(Al3+ +10-5mol·L-1DK睵GD2、CAY10471)。在加入處理因素后繼續(xù)培養(yǎng)24h，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS漂洗3次，每次1min;4%多聚甲醛固定30min，PBS漂洗3次;HE染色，鏡下觀察。
1.2.6 Ca2+熒光強(qiáng)度測定 將共聚焦專用培養(yǎng)皿中大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至d7進(jìn)行藥物處理(分組同“1.2.5”)，繼續(xù)培養(yǎng)24h。棄去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液，采用Ca2+熒光探針Fluo3/AM標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)Ca2+，通過激光掃描共聚焦顯微鏡測定細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度。1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以珋x±s表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用單因素方差分析及Dunnett′st檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
2.1 原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元NSE免疫化學(xué)鑒定 培養(yǎng)至d7的神經(jīng)元，在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察，其胞體飽滿有光暈，軸突和樹突明顯，突起交錯連接成網(wǎng)狀。經(jīng)NSE免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，陽性細(xì)胞胞體及突起呈棕黃色;蘇木精復(fù)染后，陽性細(xì)胞胞核呈藍(lán)色。隨機(jī)取6個視野，每個視野挑選100個細(xì)胞，計(jì)數(shù)NSE陽性細(xì)胞并計(jì)算其所占百分比。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，超過95%為陽性細(xì)胞(Fig1)。
2.2 DP2干預(yù)對鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元存活力的影響
2.2.1 DK睵GD2對鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元存活力的影響 與空白對照組比較，鋁負(fù)荷模型組MTT值明顯降低(P<001);與鋁負(fù)荷模型組比較，DK睵GD2干預(yù)組MTT值明顯降低，且有劑量依賴性。
2.2.2 CAY10471對鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元存活力的影響 與空白對照組比較，鋁負(fù)荷模型組MTT值明顯降低(P<001);與鋁負(fù)荷模型組比較，CAY10471干預(yù)組MTT值明顯升高，且有劑量依賴性。
2.3 DP2干預(yù)對鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元LDH漏出率的影響
2.3.1 DK睵GD2對鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元LDH漏出率的影響 與空白對照組比較，鋁負(fù)荷模型組LDH漏出率明顯升高(P<001);與鋁負(fù)荷模型組比較，DK睵GD2 干預(yù)組LDH漏出率明顯升高，10-5mol·L-1、3×10-6mol·L-1組差異有顯著性(P<001。
2.3.2 CAY10471對鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元LDH漏出率的影響 與空白對照組比較，鋁負(fù)荷模型組LDH漏出率明顯升高(P<001);與鋁負(fù)荷模型組比較，CAY10471干預(yù)組LDH漏出率明顯降低(P<001)。
2.4 DP2干預(yù)對鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)的影響 HE染色后，在正置光學(xué)顯微鏡下觀察，空白對照組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰完整，胞體呈錐形或三角形，核仁明顯，有雙極或多極突起并相互交織成網(wǎng);鋁負(fù)荷模型組海馬神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目明顯減少，突起萎縮，部分細(xì)胞核固縮;DK睵GD2干預(yù)組海馬神經(jīng)細(xì)胞幾乎全部核固縮、裂解;CAY10471干預(yù)組海馬神經(jīng)元較模型組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，胞體、胞核明顯，裂解細(xì)胞明顯減少(Fig2、3)。
2.5 DP2干預(yù)對鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元Ca2+熒光強(qiáng)度變化的影響 空白對照組海馬神經(jīng)元的Ca2+熒光強(qiáng)度極其微弱，鋁負(fù)荷模型組Ca2+熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P<001);與鋁負(fù)荷模型組比較，DK睵GD2干預(yù)組Ca2+熒光強(qiáng)度有增強(qiáng)趨勢，但差異無顯著性;CAY10471干預(yù)組Ca2+熒光強(qiáng)度明顯降低(P<001)(Tab5、Fig4)。
3 討論
鋁作為一種公認(rèn)的神經(jīng)毒劑，過量蓄積可嚴(yán)重影響人的認(rèn)知功能，進(jìn)而誘發(fā)一系列神經(jīng)系統(tǒng)疾病。與三氯化鋁、葡萄糖酸鋁等其他鋁鹽相比，麥芽酚鋁[Al(malt)3]是一種中性含鋁復(fù)合物，在生理pH條件能釋放出大量Al3+，有利于進(jìn)行鋁負(fù)荷神經(jīng)毒性的相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)采用Neurobasal培養(yǎng)基(含2% B27)進(jìn)行海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)，通過神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)特異性標(biāo)志物NSE的鑒定，其純度超過95%。參考Chen等[11]并通過我們的前期實(shí)驗(yàn)摸索，本實(shí)驗(yàn)采用100μmol·L-1麥芽酚鋁建立鋁負(fù)荷大鼠原代海馬神經(jīng)元損傷模型。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元MTT值明顯降低、LDH漏出率明顯升高、Ca2+熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯減少、突起萎縮，部分細(xì)胞核固縮。Chen等[12]對麥芽酚鋁致原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元損傷進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)Al3+通過激活Rho睷ock信號通路誘導(dǎo)神經(jīng)毒性。Johnson等[13]在原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)，麥芽酚鋁可造成神經(jīng)元呈時間和劑量依賴性凋亡，其作用機(jī)制可能與麥芽酚鋁抑制腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高有關(guān)。
我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，與鋁負(fù)荷模型組相比，DK睵GD2干預(yù)組MTT值明顯降低、LDH漏出率明顯升高、Ca2+熒光強(qiáng)度有增強(qiáng)趨勢，海馬神經(jīng)細(xì)胞幾乎全部核固縮、裂解;CAY10471干預(yù)組MTT值明顯升高、LDH漏出率明顯降低、Ca2+熒光強(qiáng)度明顯減弱，海馬神經(jīng)元較模型組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，胞體、胞核明顯，裂解細(xì)胞明顯減少。有研究報道，DP2 偶聯(lián)Gi蛋白，通過激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)，磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Ser50/Thr145)，激活糖原合成酶3(GSK3)，活化T細(xì)胞核因子的轉(zhuǎn)換，釋放炎性介質(zhì)。也有研究報道，DP2被激活后偶聯(lián)Gi蛋白，抑制cAMP水平，促進(jìn)Ca2+ 內(nèi)流，上調(diào)CD11b表達(dá)，誘導(dǎo)嗜堿性粒細(xì)胞遷移和脫顆粒，促進(jìn)IL2、IL4、IL5、IL13的釋放。Liang等[5]對天冬氨酸(NMDA)致原代海馬神經(jīng)元損傷進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)DK睵GD2 加重神經(jīng)元損傷。Schroder等[16]對炎性相關(guān)因子前列腺素H1(PGH1)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)CAY10471可抑制Th2細(xì)胞的遷移。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，DK睵GD2可能通過激動DP2，偶聯(lián)Gi蛋白，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，加重鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元損傷;CAY10471可能通過抑制DP2活性，減少Ca2+流入，對鋁負(fù)荷原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元損傷起一定保護(hù)作用。
綜上所述，DP2 激活表達(dá)可增加神經(jīng)元對鋁鹽損傷的易感性，其機(jī)制可能涉及DP2下游Ca2+信號通路的調(diào)控，但由于作用復(fù)雜，在神經(jīng)系統(tǒng)中的機(jī)制尚不完全清楚。因此，在本研究的基礎(chǔ)上，可對DP2在神經(jīng)系統(tǒng)中介導(dǎo)的下游Ca2+信號通路的具體調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究。
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