討論基于腎陽虛證候研究制首烏對肝細(xì)胞的影響論文
近年來，我國藥物性肝損害的發(fā)生率呈不斷上升的趨勢，據(jù)統(tǒng)計，我國由藥物導(dǎo)致肝損傷患者占急性肝炎患者的10%。其中，因使用中草藥而產(chǎn)生的肝損害甚至中毒致死的臨床報道也呈逐年上升趨勢。持續(xù)高發(fā)的中藥肝損害事件成為醫(yī)患糾紛的重要因素之一，同時也對中藥安全低毒的傳統(tǒng)認(rèn)知和優(yōu)勢構(gòu)成了巨大的挑戰(zhàn)，給中醫(yī)藥的進(jìn)一步發(fā)展、普及應(yīng)用蒙上了陰影。一些傳統(tǒng)并不認(rèn)為具有毒性的中藥，如何首烏(Polygonum multifl orum Thunb.)，陸續(xù)出現(xiàn)中毒致肝損傷的報道。何首烏經(jīng)過炮制后具有補(bǔ)益精血、固腎烏須之功，為傳統(tǒng)滋補(bǔ)腎陰的代表性藥物之一，雖已發(fā)現(xiàn)其所含的蒽醌類、鞣質(zhì)等均有一定的肝毒性，但該藥物在臨床中用于治療腎陰虛證已有千余年，卻未有肝損傷的報道。因此，筆者推測目前臨床中制首烏導(dǎo)致肝損傷的發(fā)生可能與未按辨證論治原則使用藥物，即藥不對證有關(guān)。本文以中醫(yī)證候?yàn)榛A(chǔ)，探討腎陽虛大鼠的制首烏含藥血清對L02肝細(xì)胞的影響。
材料
1. 細(xì)胞系及培養(yǎng)條件
人正常肝細(xì)胞株L02，購自湘雅中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫，在含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，37℃，5%CO2及飽和濕度條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，所有試驗(yàn)均在細(xì)胞對數(shù)生長期進(jìn)行。
2 . 藥品與試劑
R PMI-16 4 0完全培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶，購自美國Gi b co公司;噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)，購自美國Sigma公司;Annexin V-FITI/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號：20140630;何首烏藥材，購自四川成都荷花池藥材市場，批號：1209341405。
3. 動物
SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，3月齡，購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK(陜)2012-003，飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。飼養(yǎng)環(huán)境保持室溫20-25℃，相對濕度40%-60%，實(shí)驗(yàn)動物自由進(jìn)食和飲水。
4. 儀器
Cell Lab流式細(xì)胞儀，美國貝克曼公司;AE-21倒置顯微鏡，麥克奧迪公司;CB-150二氧化碳培養(yǎng)箱，德國Binder公司;DHG-9075 A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司;TGL-16G高速臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;EX-8080酶標(biāo)儀，美國BIO-TEK公司;TS100-F倒置熒光數(shù)碼顯微鏡，日本Nikon公司。
方法
1. 制首烏藥材及水煎液的制備
將生何首烏按照2010年版《中華人民共和國藥典》方法(清蒸法)進(jìn)行炮制，隨后將制首烏分別按照高、中、低濃度進(jìn)行煎煮。煎煮方法為：將制首烏置于煎煮容器中，加入相當(dāng)于藥材量5倍的冷水浸泡60min，煮沸30min，再加入相當(dāng)于藥材量3倍的冷水繼續(xù)煎煮，20min后，煎煮液濃縮。
2. 制首烏含藥血清的制備
SD大鼠40只，隨機(jī)分為4組，每組10只。其中，3組大鼠皮下注射氫化考的松，每日1次，25mg/kg，連續(xù)14d，造成腎陽虛證模型[9]，另1組為生理鹽水組。隨后各組分別以高(43.2g/kg)、中(21.6g/kg)、低濃度(10.8g/kg)的制首烏水煎液及0.9%氯化鈉溶液灌胃，每天給藥2次，連續(xù)7d，末次給藥1h后乙醚麻醉大鼠，無菌條件下心臟取血，立即注入無菌管里，室溫靜置，待血液凝固，血清析出后，吸取上清液離心，3 000r/min，10min后再吸取上清液，即得制首烏含藥血清。血清混合后，置于56℃水浴中滅活30min，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。經(jīng)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)無微生物污染后，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
3. MTT法測定肝細(xì)胞線粒體功能
將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基5mL，置37℃、5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，鏡下觀察細(xì)胞貼壁生長情況。取生長狀態(tài)良好的同一批傳代細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，用10%FBS的RPME-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸，以每孔103-104個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積為100μL，繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步化。各組分別加入高、中、低濃度的制首烏含藥血清及正常大鼠血清(終濃度為15%)，每組6個復(fù)孔，設(shè)只加培養(yǎng)基的調(diào)零孔3個。置37℃、5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48h。每孔加入MTT溶液(5g/L，用PBS配制，pH=7.4)10μL。繼續(xù)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4h，小心地將每孔的.培養(yǎng)液吸出，加入DMSO150μL，在搖床上中速搖勻10min。酶標(biāo)儀490nm波長，檢測各孔光吸收值(A)。
4. 流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)測定
肝細(xì)胞凋亡率 取生長狀態(tài)良好的同一批傳代細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化液消化，用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，以2×104/mL，每孔2mL接種于6孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步化。各組分別加入15%高、中、低濃度的制首烏含藥血清培養(yǎng)48h，生理鹽水組以生理鹽水組大鼠血清代替，更換新的10%FBS+MEM培養(yǎng)液200μL。細(xì)胞經(jīng)處理到所需時間后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗3次后，應(yīng)用AnnexinV-PI雙標(biāo)試劑盒，按照試劑盒說明書要求，采用FCM及熒光顯微鏡分別檢測和觀察細(xì)胞凋亡情況。用流式細(xì)胞儀計數(shù)位于凋亡區(qū)內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量得到凋亡細(xì)胞百分率。
5. Annexin V-FITC/PI雙染色熒光顯微鏡觀察
L02肝細(xì)胞凋亡狀態(tài) 取生長狀態(tài)良好的同一批傳代細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化液消化，用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，接種于含蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，各組分別加入15%高、中、低濃度的__制首烏含藥血清培養(yǎng)48h，生理鹽水組以生理鹽水組大鼠血清代替。用PBS洗滌細(xì)胞2次，在50 0μL的Binding Buffer中加入5μL Annexin V-FITC，5μLPropidium Iodide，混勻后滴加于蓋玻片表面，使蓋玻片表面均勻覆蓋。避光、室溫反應(yīng)5min。將蓋玻片倒置于載玻片上，用熒光顯微鏡、雙色濾光片觀察。
6. 統(tǒng)計學(xué)方法
數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，計量資料以x-±s表示，單因素方差分析(One-way ANOVA)比較多組間的差異性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果
1.制首烏含藥血清對L 0 2肝細(xì)胞增殖的影響
見圖1。與生理鹽水組相比，15%腎陽虛各濃度組含藥血清作用24h及48h后，均對L02肝細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，其中，腎陽虛中、高濃度組含藥血清作用48h后對L02肝細(xì)胞增殖的抑制率分別為15.23%、24.92%，與生理鹽水組比較，差異顯著(P<0.05，P<0.01)。
2. 制首烏含藥血清對L02肝細(xì)胞凋亡率的影響
收集經(jīng)制首烏含藥血清處理后的L02肝細(xì)胞，用Annexin V-PI雙標(biāo)試劑盒，進(jìn)行AV/PI雙染后用流式細(xì)胞儀檢測L02肝細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：Annexin V-/PI-為正常細(xì)胞，Annexin V+/PI-為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V+/PI+為晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞，Annexin V-/PI+為細(xì)胞膜機(jī)械損傷的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各組均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞多為晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞。與生理鹽水組相比，腎陽虛各濃度組細(xì)胞凋亡率均出現(xiàn)明顯升高，其中，腎陽虛中、高濃度組細(xì)胞凋亡率與生理鹽水組比較，差異顯著(P<0.01)。
3. 制首烏含藥血清對L02肝細(xì)胞凋亡熒光染色的影響
雙染后，正常細(xì)胞無熒光;細(xì)胞膜綠色熒光為早期凋亡細(xì)胞，細(xì)胞膜綠色熒光而細(xì)胞核紅色熒光為晚期凋亡細(xì)胞，紅色熒光為壞死細(xì)胞。生理鹽水組中凋亡細(xì)胞較少，腎陽虛大鼠制首烏含藥血清給藥后，其中，腎陽虛中、高濃度組出現(xiàn)早期凋亡及晚期凋亡的細(xì)胞較多。
討論
中醫(yī)傳統(tǒng)理論認(rèn)為，中藥的毒性是其治療作用的基礎(chǔ)�！毒霸廊珪ゎ惤�(jīng)》云：“藥以治病，因毒為能，所謂毒者，因氣味之有偏也??所以去人之邪氣”。《黃帝內(nèi)經(jīng)》中記載有“有故無殞”之說，明代醫(yī)家張景岳解釋道：“大積大聚之故，有是故而用是藥，所謂有病則病受之??非用毒藥不能攻，攻亦無害，故可犯也”。明確提出了“有病則病受之”的觀點(diǎn)，提示在認(rèn)識中藥時不應(yīng)孤立地去研究藥物本身，而應(yīng)該著眼于藥物與機(jī)體的相互關(guān)系。當(dāng)機(jī)體有邪氣時，藥物作用于病邪，表現(xiàn)出的是治療作用，而當(dāng)藥物作用于正常機(jī)體時，所謂偏性(毒性)就有可能作用于機(jī)體本身，因此，本文在建立腎陽虛大鼠模型的基礎(chǔ)上，來研究制首烏含藥血清對L02肝細(xì)胞的影響。
本課題采用對大鼠注射氫化考的松的方法，建立腎陽虛模型，造模后與生理鹽水組比較，腎陽虛各濃度組大鼠出現(xiàn)形體消瘦，體毛稀疏、脫毛，拱背，蜷曲，肢尾冷、擠臥在一起，肛溫降低等表現(xiàn)，符合中醫(yī)陽虛證的臨床表現(xiàn)[9]。其后分別采用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)及熒光染色觀察腎陽虛證制首烏含藥血清對L02肝細(xì)胞增殖及凋亡狀態(tài)的影響。MTT法是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法，其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。DMSO能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。
FCM是一種在功能水平上對單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的檢測手段，與傳統(tǒng)的熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)。細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，而Annexin V是一種Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對PS有高度的親和性，可充當(dāng)檢測PS的敏感探針。PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所獨(dú)特的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中，碘化丙啶(PI)則能透過凋亡中晚期的細(xì)胞核死細(xì)胞并使細(xì)胞核染紅。因此，本文采用Annexin V結(jié)合PI染料以檢測區(qū)分不同凋亡時期的細(xì)胞。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，15%腎陽虛各濃度組含藥血清作用24h及48h后，均對L02肝細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，腎陽虛高濃度組含藥血清作用48h后細(xì)胞抑制率達(dá)24.92%。腎陽虛中、高濃度組的細(xì)胞凋亡率明顯升高，分別為27.54%和30.75%。Annexin V-FITC/PI熒光染色結(jié)果也顯示，腎陽虛中、高濃度組出現(xiàn)早期凋亡及晚期凋亡的細(xì)胞明顯增多。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，制首烏腎陽虛含藥血清作用于肝細(xì)胞后，肝細(xì)胞增殖的抑制率及肝細(xì)胞凋亡率均出現(xiàn)顯著性增高，且呈劑量相關(guān)性，提示腎陽虛證為制首烏致肝損傷的靶向證候。本研究為臨床上正確使用制首烏，避免不良反應(yīng)的出現(xiàn)提供了依據(jù)，制首烏為傳統(tǒng)的滋補(bǔ)腎陰的代表性藥物，在臨床應(yīng)用時應(yīng)辨證施治，避免應(yīng)用于腎陽虛證候藥不對證的情況出現(xiàn)。
【討論基于腎陽虛證候研究制首烏對肝細(xì)胞的影響論文】相關(guān)文章：
研究艾灸對腎陽虛大鼠的影響隨機(jī)平行對照論文10-31
亞健康與體質(zhì)及證候的關(guān)系研究論文11-02
基于學(xué)分制的企業(yè)人才培養(yǎng)模式探討論文06-04
基于無障礙設(shè)計理念的電梯設(shè)計討論與研究論文10-29
音樂對心理影響的探討論文09-15
關(guān)于權(quán)責(zé)發(fā)生制的探討論文04-12
基于員工心理契約的影響探究論文09-14
基于課堂的教師行動研究的論文10-21