基因工程在林木抗寒中的應(yīng)用研究論文

　　摘要：文章綜述了基因工程在林木抗寒方面的研究進(jìn)展， 包括結(jié)構(gòu)基因、順式作用元件、轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)基因技術(shù)。

　　關(guān)鍵詞：基因工程； 林木； 抗寒；

　　逆境會傷害植物， 嚴(yán)重時會導(dǎo)致死亡。當(dāng)溫度下降到0℃以下時， 植物體內(nèi)發(fā)生冰凍， 因而受傷甚至死亡， 這種現(xiàn)象稱為凍害。樹木在生長期中如遇到溫度的突然變化， 會打亂植物生理進(jìn)程的程序而造成傷害， 迄今為止， 尚沒有解決低溫凍害的根本辦法。隨著基因工程的發(fā)展， 在樹木的抗寒性研究方面取得了進(jìn)展。本文就結(jié)構(gòu)基因、順式作用元件、轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)基因技術(shù)在林木抗寒中的應(yīng)用與研究進(jìn)展進(jìn)行了闡述， 以期為林木抗寒相關(guān)研究提供參考。

　　1 結(jié)構(gòu)基因

　　結(jié)構(gòu)基因是一類編碼蛋白質(zhì)的基因， 大多數(shù)真核生物的基因是不連續(xù)基因。所謂不連續(xù)基因就是指基因的編碼序列在DNA分子上是不連續(xù)的， 被非編碼序列所隔開。編碼的序列稱為外顯子， 是一個基因表達(dá)為多肽鏈的部分；非編碼序列稱為內(nèi)含子， 又稱插入序列。內(nèi)含子只轉(zhuǎn)錄， 在前mRNA時被剪切掉。一些抗寒相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因， 通過轉(zhuǎn)錄形成RNA， 再通過翻譯形成相關(guān)的蛋白質(zhì)， 進(jìn)而表現(xiàn)出抗寒的特性。2003年， 李春霞從胡蘿卜中克隆得到抗凍蛋白基因， 并轉(zhuǎn)入山楊， 得到轉(zhuǎn)基因植株后經(jīng)PCR檢測獲得1株卡那霉素的轉(zhuǎn)基因株系， 結(jié)果表明目的基因AFP基因已被整合進(jìn)山楊基因組中[1]。2007年， Benedict等將擬南芥抗寒相關(guān)基因CBF1基因轉(zhuǎn)化到楊樹基因組中， 并證明該基因的成功表達(dá)可提高楊樹的抗寒性。

　　2 順式作用元件

　　順式作用元件， 位于結(jié)構(gòu)基因的旁側(cè)， 包括啟動子、增強(qiáng)子、應(yīng)答元件。它是轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)， 并通過這種結(jié)合進(jìn)而調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄， 確保轉(zhuǎn)錄的精確起始和轉(zhuǎn)錄效率。目前此方面在林木中研究較少， 相對滯后。此外， Li等[2]研究表明不同基因啟動子對抗逆基因的表達(dá)作用不同， 其中cor15基因啟動子要弱于cor15b基因啟動子對抗逆基因表達(dá)活性的影響， 此外還發(fā)現(xiàn)這種影響不僅與順式作用元件種類有關(guān)， 也與其數(shù)量密切相關(guān)。Khurana等[3]發(fā)現(xiàn)CCAAT—box和HSEs作為小分子熱激蛋白sHSP26啟動子中重要的熱激元件在表達(dá)調(diào)控中起了決定性的作用。

　　3 轉(zhuǎn)錄因子

　　轉(zhuǎn)錄因子即能夠結(jié)合在基因上游的特異核苷酸序列上的蛋白質(zhì)， 并能調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控核糖核酸聚合酶 （RNA聚合酶， 或叫RNA合成酶） 與DNA模板的結(jié)合。同時在與該基因上游的啟動子區(qū)域結(jié)合的同時， 轉(zhuǎn)錄因子還可以與其他一些轉(zhuǎn)錄因子形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體， 進(jìn)一步影響基因的轉(zhuǎn)錄， 進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的合成。2014年， 羅夢雪等[4]從麻瘋樹基因組中克隆到一個CBF2基因 （命名為JcCBDF2） 。運(yùn)用生物信息學(xué)的分析手段對該基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了分析， 結(jié)果表明， JcCBDF2蛋白中不止包含AP2/EREBP保守的結(jié)合結(jié)構(gòu)域， 還具有CBF轉(zhuǎn)錄因子特征序列。實時熒光定量結(jié)果顯示基因主要在麻瘋樹葉片內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達(dá)， 對低溫脅迫極其敏感， 初步研究表明基因是低溫誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子。趙天田， 王貴禧， 梁麗松等[5]根據(jù)平榛花芽轉(zhuǎn)錄本高通量測序的結(jié)果， 采用RACE—PCR技術(shù)克隆到平榛S4OQ基因， 并對基因進(jìn)行實時熒光定量表達(dá)分析， 表明：平榛雌花芽中的表達(dá)量最高， 隨后表達(dá)量逐漸下降， 在不同器官中的表達(dá)具有差異性， 雄花序中表達(dá)量最高。楊杞， 白肖飛， 高陽等[6]以沙冬青為試驗材料， 利用RT—PCR和RACE技術(shù)克隆了沙冬青CBF/DREB1基因cDNA序列， 并對其進(jìn)行了序列分析， 運(yùn)用生物信息學(xué)預(yù)測其編碼的氨基酸序列具有CBF家族基因特有的AP2結(jié)構(gòu)域。為進(jìn)一步研究植物抗逆和獲得抗性基因提供了新的候選基因。

　　4 其他

　　4。1 小G蛋白基因

　　小G蛋白分子量約為20—30KD具有GTP酶活性， 在多種細(xì)胞反應(yīng)中起開關(guān)作用。當(dāng)小G蛋白與GTP結(jié)合時成為活化形式， 作用于下游分子并將其活化。當(dāng)GTP水解成為GDP時， 小G蛋白恢復(fù)為非活化狀態(tài)。黃亞成等[7]從橡膠樹膠乳cDNA文庫中克隆1個小G蛋白的基因全長， 進(jìn)行了聚類和表達(dá)分析， 采用實時熒光定量的方法研究該基因低溫處理下的表達(dá)水平。結(jié)果顯示4℃低溫脅迫下該基因在橡膠樹幼苗根中的表達(dá)明顯受誘導(dǎo)且在脅迫初期表達(dá)最強(qiáng)， 后又有所下降， 為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

　　4。2 microRNA

　　microRNA （或miRNA） 是指參與轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)調(diào)控， 由內(nèi)源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子， 長度約為22個核苷酸。目前， 關(guān)于MicroR—NA的調(diào)控機(jī)理還不太清楚。2012年， 張譯云[8]以毛白楊為材料， 進(jìn)行不同時間段 （0、8、14、20h） 的低溫脅迫 （4℃） 處理， 分別提取小片段RNAs （<200nt） ， 利用實時定量PCR技術(shù)研究毛白楊在低溫脅迫后12種miRNAs的.差異表達(dá)規(guī)律。結(jié)果顯示， miRNAs的表達(dá)在低溫脅迫下有顯著變化， 且呈現(xiàn)動態(tài)反應(yīng)。在低溫脅迫下， 大部分miRNAs的表達(dá)受到抑制。miR168a、miR169ac、miR394a—3p、miR530a的表達(dá)量在各個時間段顯著下調(diào)。表明， miRNAs在調(diào)控毛白楊對低溫脅迫的反應(yīng)中起著重要作用。2012年， 張譯云以毛白楊為試材， 通過構(gòu)建microRNA的cDNA文庫， 經(jīng)高通量測序獲得144個保守microRNA和29個新microRNA， 并用生物信息學(xué)方法預(yù)測了新microRNA的101個靶基因， 且這些靶基因均與植物生長或逆境脅迫密切相關(guān)。該研究對進(jìn)一步探討microRNA在毛白楊經(jīng)低溫脅迫后的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

　　5 林木抗寒展望

　　目前， 抗寒性研究是林業(yè)抗逆性研究中重要一項， 并已深化到基因水平。雖然轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在一定的爭議而且植物抗寒性狀作為質(zhì)量性狀多受多基因控制， 抗寒分子機(jī)制相對復(fù)雜， 目前對這方面的研究仍不夠透徹， 經(jīng)基因轉(zhuǎn)化獲得的抗寒性植株還有很大的盲目性。但利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)增加林木抗寒性， 并不涉及食品安全問題， 同時一些寒冷脅迫應(yīng)答基因已陸續(xù)被鑒定， 很多關(guān)鍵基因已通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功提高了林木的抗寒性。近年來， 在大數(shù)據(jù)時代的潮流中， 基因芯片、轉(zhuǎn)錄組等高通量生物技術(shù)的成功應(yīng)用進(jìn)一步加快了抗寒相關(guān)候選基因的鑒定， 因此運(yùn)用基因工程技術(shù)改善植物抗寒性將擁有越來越好的前景。

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　　[7]黃亞成， 秦云霞， 劉林婭， 等。橡膠樹HbRAN1基因的克隆與表達(dá)[J]。熱帶作物學(xué)報， 2013， 34 （7） ：1257—1263

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