研究逍遙散乙醇的提取物抗抑郁譜效關系論文
中藥的“譜- 效”關聯(lián)是指構(gòu)建中藥的“譜”和適合的藥效評價模型，采用數(shù)據(jù)處理技術將圖譜數(shù)據(jù)和藥理學數(shù)據(jù)進行關聯(lián)，建立譜- 效關系。測定1H-NMR 譜圖需要較少樣品，掃描時間短，容易獲得，因此被廣泛應用。1H-NMR 圖譜可以客觀、全面地反映中藥化學成分的特征。陳璟等在當前中藥指紋圖譜譜效相關性研究思路的基礎上提出了基于“工藝- 指紋圖譜- 效應”研究模式。目前常用的譜- 效關系分析方法主要有灰度關聯(lián)分析、相關分析、回歸分析和聚類分析。逍遙散出自宋代《太平惠民合劑局方》，由柴胡、當歸、白芍、白術、(炙)甘草、茯苓、干姜和薄荷8 味藥材組成，現(xiàn)代臨床以及藥理研究表明逍遙散有明顯的抗抑郁作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)逍遙散低極性組分抗抑郁作用明顯[7，8]，采用灰度關聯(lián)分析和相關分析對XYE-E 的譜效關系進行研究，表征其藥效物質(zhì)基礎，為逍遙散的新藥效開發(fā)提供依據(jù)。
1 材料和試劑
1.1 植物材料
逍遙散藥材組成為：柴胡30 g，當歸30 g，白術30 g，白芍30 g，茯苓30 g，甘草15 g，生姜10 g，薄荷10 g;以上藥材均購自山西省華陽藥業(yè)有限公司，經(jīng)山西大學中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心秦雪梅教授鑒定為正品。
1.2 儀器和試劑
RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);Bruker 600 MHz Avance Ⅲ NMR 譜儀(德國Bruker公司);Centrifuge TDL-5 型離心機(上海安亭科學儀器廠);BSA124S 分析天平(SI 德國賽多利斯公司);溫度計;計時器;有機玻璃缸等。鹽酸文拉法辛膠囊(25 mg/ 粒，批號120401，成都康弘藥業(yè)集團股份有限公司);氘代甲醇(99.8%，德國默克公司)。
1.3 動物
雄性ICR 小鼠，SPF 級，動物許可證號：SCXK(京)2011-0012，18~22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物自然晝夜節(jié)律光照，適應1 周后進行實驗。
2 方法
2.1 XYE-E 的制備
XYE-E 按照以下工藝進行制備: 處方量的逍遙散藥材，加入8 倍量75% 乙醇回流提取1.5 h，濾過，濾液濃縮至一定量后，加等倍量的乙酸乙酯萃取，振搖0.5 h，靜置0.5 h，共萃取3 次，合并萃取液，濃縮，蒸干得XYE-E。
2. 2 XYE-E 的1H-NMR 圖譜測定
稱取XYE-E 約25 mg，加700 μL 氘代甲醇溶解，溶解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，13 000 rpm 轉(zhuǎn)低溫離心10 min，移取600 μL 上清液于核磁管中，平行制備6 份，進行1H-NMR 測定。XYE-E 在25℃下于600 MHz NMR 儀上測定(頻率600.13 MHz)，采用ZG30 序列，掃描次數(shù)為64，脈沖間隔為1.0 s，延遲時間為5.0 s。氘代甲醇(δ 3.30 ppm)用于鎖場和定標。
2.3 小鼠懸尾實驗
雄性ICR 小鼠適應1 周后，隨機分為3 組，每組12只，分別為空白組，陽性組(鹽酸文拉法辛0.05 g·kg-1)，XYE-E 組(生藥46 g·kg-1)。XYE-E 使用前用0.5%CMC-Na 與0.5% 吐溫80 混合物稀釋至相應濃度，鹽酸文拉法辛使用生理鹽水稀釋至同等濃度，各組灌胃給藥20 mL·kg-1，空白組給予等量色拉油，連續(xù)14 d。末次給藥1 h 后，將小鼠尾尖1 cm 處黏貼于懸掛鉤上，并且手托小鼠將其掛入動物行為視頻分析系統(tǒng)觀察箱中，記錄6 min 內(nèi)小鼠的絕望行為，分析后4 min 內(nèi)小鼠的不動時間。
2.4 小鼠強迫游泳實驗動物分組及給藥同“2.3”項下。末次給藥1 h 后，用動物行為視頻分析系統(tǒng)記錄6 min 內(nèi)小鼠的游泳行為狀況，分析后4 min 內(nèi)小鼠的不動時間。
2.5 數(shù)據(jù)分析
核磁圖譜采用MestReNova 進行處理。譜- 效的數(shù)據(jù)處理采用相關分析(SPSS 16.0)和灰度關聯(lián)分析。
3 結(jié)果與分析
3.1 藥效學評價
XYE-E 對小鼠懸尾實驗和強迫游泳實驗中不動時間的影響如圖1 所示，XYE-E 能減少小鼠懸尾實驗和強迫游泳實驗中的不動時間，與空白對照組比較均具有顯著性差異(P < 0.01)，表明XYE-E具有明顯的抗抑郁作用。
3.2 XYE-E 特征峰的選擇與定量
XYE-E 的1H-NMR 圖譜，共指認出14 種化學物質(zhì)，分別為柴胡皂苷類，阿魏酸，藁本內(nèi)酯，白術內(nèi)酯，芍藥苷，甘草苷等物質(zhì)，結(jié)果見表1。在1H-NMR 圖譜中，共振峰面積或峰高與產(chǎn)生該共振峰的質(zhì)子數(shù)成正比，這是定量的依據(jù)，在沒有對照品時，可利用特征峰相對含量法對物質(zhì)的含量進行宏觀分析。用于定量分析的特征峰應不受其他信號干擾，并且達到特征峰兩側(cè)的基線平坦。對提取物核磁圖譜采用0.01 分段積分、歸一化處理后，分別求算14 種化學物質(zhì)特征峰的相對峰面積，用相對峰面積表示物質(zhì)的相對含量。
3.3 灰度關聯(lián)分析
為了進一步研究逍遙散提取物中14 種活性成分對抗抑郁作用的貢獻大小，進行了灰度關聯(lián)分析。令Y=(y1,y2,......,yn) 為藥效數(shù)據(jù)向量，Si=(Si,1,Si,2,......Si,n) 為相對峰面積數(shù)據(jù)向量，其中i=1,2,......,m)。(1)原始數(shù)據(jù)變換：將各原始數(shù)據(jù)除以該列數(shù)據(jù)的均值，進行規(guī)格化處理。(2)計算灰色關聯(lián)系數(shù)：其中;△ij=|yi-sij |(3)計算灰色關聯(lián)度：(4)排列順序：XYE-E 的1H-NMR 圖譜與FST 和TST 不動時間的灰度關聯(lián)分析，依據(jù)關聯(lián)度的大小，確定了各成分對抗抑郁作用貢獻的大小順序，其中白術內(nèi)酯Ⅰ，白術內(nèi)酯Ⅱ，柴胡皂苷a，柴胡皂苷c，柴胡皂苷E，柴胡皂苷F，柴胡皂苷G，柴胡皂苷b2與藥效相關度較高(相關度大于0.700)。
3.4 相關分析
將1H-NMR 圖譜中指認化學物質(zhì)的相對峰面積與其FST 和TST 不動時間的數(shù)據(jù)進行相關性分析，利用SPSS 16 統(tǒng)計軟件進行雙變量相關分析法(Bivariate)，分析結(jié)果見表3。從表3 可以看出，柴胡皂苷d 和柴胡皂苷E 與FST 不動時間的相關性較高(P<0.05，P<0.01);柴胡皂苷b2，柴胡皂苷a 和柴胡皂苷G 與TST 不動時間的相關性較高(P<0.05，P<0.01)。與灰度關聯(lián)分析的結(jié)果一致，說明柴胡皂苷是逍遙散中發(fā)揮抗抑郁作用的主要成分，同時也證實了柴胡在逍遙散中的君藥地位。
3.5 強迫引入回歸分析
采用SPSS 中多元線性回歸分析中的強迫引入法(enter)對相關性大的化學成分(P<0.05)進行多元回歸分析，以有效成分峰面積作為自變量，F(xiàn)ST和TST 不動時間為因變量，建立方程。在14 個色譜峰中X4(柴胡皂苷d)、X6(柴胡皂苷E)、X8(柴胡皂苷G)3 個與藥理數(shù)據(jù)密切相關的色譜峰被引人回歸方程。所得方程為：YFST= -90.88-210.88X4+1 496.32X6(F=18.437，P=0.021，R2=0.925)Y T S T= - 1 2 7 3 . 2 5 + 7 9 3 2 . 7 9 X 8 ( F = 1 0 . 6 7 7 ，P=0.031，R2=0.727)FST 和TST 模型擬合后的決定系數(shù)R2 分別為0.925 和0.727，即變量的變差可以解釋全部抗抑郁藥理活性變化的93% 和73%。模型的方差分析均顯示P<0.05，說明此回歸模型有統(tǒng)計學意義。FST 和TST 殘差的分布結(jié)果符合正態(tài)分布假設，預測值的累積概率與觀測值的累積概率的散點基本散布在直線上，說明自變量與因變量之間符合線性關系，并且標準化殘差在0 的附近波動，滿足殘差的方差齊性條件。強迫引入法分析結(jié)果顯示柴胡皂苷d，柴胡皂苷E，柴胡皂苷G 所對應的化學成分對FST 和TST 不動時間具有較大影響。結(jié)合灰度關聯(lián)分析和相關分析研究，表明柴胡皂苷d、柴胡皂苷E 和柴胡皂苷G 與藥效的相關性最大，但是其余未指認的'色譜峰所對應的化學成分是否有抗抑郁作用，有待于進一歩研究。
4 討論
XYE-E 的1H-NMR 圖譜包含了XYE-E 中所有物質(zhì)的氫信號，通過對1H-NMR 指紋圖譜中的特征峰進行分析，共指認出14 種化合物，包括柴胡皂苷類物質(zhì)，白術內(nèi)酯類物質(zhì)以及甘草苷、芍藥苷等。
譜效關系研究可以發(fā)現(xiàn)和跟蹤藥效物質(zhì)，指導制備工藝的優(yōu)化，保證中藥的臨床療效。本研究發(fā)現(xiàn)與XYE-E 抗抑郁藥效密切相關的物質(zhì)主要是柴胡皂苷，甘草苷和芍藥苷與抗抑郁藥效相關度并不高。采取不同提取分離工藝所得提取物的化學組分和含量均不同，從而引起圖譜特征信息變化和相關藥效的改變。
中藥化學組成復雜，單張化學圖譜難以完整地反映中藥的化學組成特征，因此建立多源譜效關系，完整表征中藥復方的整體化學特征顯得尤為重要。本研究中未被指認的色譜峰需進一步分析，對XYE-E 中的化學成分進行更深入的分析和譜效關系研究。
綜上所述，中藥復方譜效關系的研究對于優(yōu)化中藥生產(chǎn)工藝，追蹤和篩選藥效活性成分，加快中藥新藥研究等方面具有重要的推動作用。
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